A dor pode ser descrita como uma “experiência sensorial, com tonalidade afetiva desagradável, oposta ao prazer, induzida por estímulos (nocivos/nociceptivos) mecânicos, térmicos, químicos, elétricos ou fisiopatológicos”. A esta sensação (dor/nocicepção) estão associadas respostas neurovegetativas ou comportamentais, que são mais intensas ou mais rápidas quando o tecido está inflamado. Considerando aspectos comportamentais como reações no sentido de evitar estímulos desagradáveis, pode-se dizer, também, que a dor é um sintoma com finalidade protetora, que “alerta” a presença de ameaças, protegendo a integridade física do organismo no ambiente e defendendo-o contra agentes infecciosos, “avisando” a ocorrência de distúrbios patológicos orgânicos por meio dos sistemas imunes inato e adaptativo.

 

Entretanto, a definição do conceito “dor” não é tão fácil, uma vez que componentes subjetivos próprios do indivíduo podem alterar a sensação produzida por estímulos nocivos. Desta forma, é interessante relacioná-la às vias nervosas especializadas em detectar a presença de estímulos nocivos, ou que podem se tornar nocivos caso permaneçam. Tais vias são conhecidas como vias nociceptivas, e são compostas por fibras neuronais que são ativadas por estimulação intensa.

 

Essa discussão surgiu do fato de que muitos dos experimentos realizados com metodologias que empregam estímulos dolorosos são realizados em animais, os quais apresentam reações comportamentais compatíveis com a sensação de dor, porém, uma vez que não é possível determinar objetivamente se a sensação apresentada é realmente dor – já que o animal não pode se comunicar -, é preferível classificá-la como sendo resultado da ativação das vias nociceptivas. Portanto, podemos denominar tais reações em animais experimentais como nocicepção.

 

Considerando que a investigação científica da hipernocicepção e nocicepção de origem inflamatória pode ser realizada seguindo vários protocolos, nesta seção de nosso Portal DOL apresentamos uma breve descrição dos métodos mais utilizados em laboratórios para avaliação de comportamentos apresentados por animais submetidos à experiência dolorosa (ou nociceptiva, como explicado acima). É importante salientar que a utilização destes testes deve estar sempre condicionada à submissão de seu protocolo ao Comitê de Ética de cada instituição, para que a metodologia seja analisada de acordo com normas internacionais de experimentação animal, e, sua realização, aprovada. Desta forma, todos os ensaios mostrados abaixo foram previamente aprovados pela CETEA - Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP, em estudos relacionados a trabalhos científicos do grupo de dor e inflamação do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

 

São apresentados dois tipos de testes: os que avaliam a ação de drogas sobre comportamentos indicativos de dor manifesta (ou nocicepção manisfesta), nos quais o estímulo utilizado causa, por si só, a ativação das vias nociceptivas, induzindo o comportamento compatível com dor (como nos casos do teste de formalina ou de contorções abdominais com ácido acético), e os modelos de avaliação de hipernocicepção, nos quais é feita a administração de drogas que induzem a sensibilização das fibras neuronais nociceptivas. Nestes últimos, são avaliados parâmetros que indiquem e presença de fenômenos como a hipernocicepção ou alodinia, ou seja, nos quais ocorre diminuição do limiar de tolerância à estimulação de caráter mecânico, térmico ou químico.

 

Ainda, ao final de cada item, apresentamos referências bibliográficas de trabalhos que abordam tais metodologias.

 

1. Ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,1 N

1.1 - Animais

Camundongos ou ratos.

 

1.2 - Tipo de teste

Nocicepção manifesta por injeção de agente algésico.

 

1.3 - Detalhamento do teste

Vídeo 1: Demonstrativo do ensaio de contorções (arquivo ASF, tamanho aproximado 1,2 MB)

Após a injeção intraperitoneal (ip) de um agente nociceptivo em ratos ou camundongos, observa-se respostas que consistem em uma seqüência de contorções e extensões do abdômen, algumas vezes acompanhada por torções do tronco e extensão dos membros posteriores do animal. Este comportamento foi denominado de contorção abdominal por Whittle em 1964.

 

Para o ensaio são utilizados camundongos suíços de ambos os sexos, com peso entre 18 e 25 gramas. Ratos de pouca idade (100 g) também podem ser submetidos ao teste. Os animais são mantidos em jejum por um período de 8 horas. As substâncias devem ser administradas preferencialmente por via oral. Trinta minutos após a administração das drogas a serem testadas, é feita a injeção do estímulo algésico, ou seja, injeta-se ácido acético 0,1N na cavidade peritoneal dos animais (0,1 ml/10 g de peso do animal). Dez minutos após administração do ácido acético inicia-se a contagem das contorções, durante vinte minutos.

 

1.4 - Bibliografia

• COOLIER, H.O.J; et al. (1968) The abdominal constriction response and its suppression by analgesic drugs in the mouse. Br. J. Pharmac. Chemother. 32, 295-310;

• WHITTLE, B.A. (1964) The use of changes in capillary permeability in mice to distinguish between narcotic and non narcotic analgesics. Br. J. Pharmac. Chemother., 22, 246-253.

2. Teste da formalina

2.1 - Animais

Camundongos ou ratos.

 

2.2 - Tipo de teste

Nocicepção manifesta por injeção de agente algésico.

 

2.3 - Detalhamento do teste

Vídeo 2: Demonstrativo do teste da formalina (arquivo ASF, tamanho aproximado 700 KB)

Camundongos suíços de ambos os sexos deixados em jejum por um período de 8 horas, ou ratos com peso entre 100 e 200 g, recebem administração subplantar de 20 µl de uma solução de formalina 2,5% na pata traseira. Uma hora antes da administração da formalina drogas a serem testadas são administradas por via oral na dose de 100 µmol/kg numa suspensão com goma arábica 5%, podendo ser administradas na pata dos animais em casos nos quais têm-se a intenção de observar seu efeito local. O tempo que o animal lambe, sacode (comportamento conhecido como “flinch”) ou morde a pata traseira é então cronometrado. São observadas duas fases distintas. A primeira fase (0-5 minutos pós-injeção) é chamada de fase neurogênica, na qual ocorre a ativação direta dos nociceptores locais pela formalina, e a segunda (15-30 minutos após a injeção) é chamada de fase inflamatória, na qual o comportamento observado é resultante da ação de mediadores inflamatórios liberados pelo estímulo.

 

Variações do teste de formalina têm sido utilizadas na pata dianteira ou mesmo na região da articulação temporomandibular (ATM) de ratos.

 

2.4 - Bibliografia

• HUNSKAAR S, HOLE K. (1987) The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and non-inflammatory pain. Pain. 30:103-14. [Veja artigo original]

• PARADA CA, TAMBELI CH, CUNHA FQ, FERREIRA SH. The major role of peripheral release of histamine and 5-hydroxytryptamine in formalin-induced nociception. Neuroscience. 2001;102(4):937-44. [Veja artigo original]

• 2.3) ROVERONI RC, PARADA CA, CECILIA M, VEIGA FA, TAMBELI CH. Development of a behavioral model of TMJ pain in rats: the TMJ formalin test. Pain. 2001 Nov;94(2):185-91. [Veja artigo original]

 

3. Ensaio da placa quente

3.1 - Animais

Camundongos ou ratos.

 

3.2 - Tipo de teste

Nocicepção térmica manifesta por reflexo de retirada de pata.

 

3.3 - Detalhamento do teste

A atividade analgésica central pode ser avaliada por meio do teste da placa quente. Neste teste, o equipamento, que consiste de uma placa de metal, é aquecido até a temperatura de 55 (±1) °C. Embora KURAISHI et al (1983) tenha descrito primeiramente o teste para uso em camundongos, muitos experimentos são feitos com ratos. Originalmente, camundongos suíços de ambos os sexos, com pesos entre 18 e 25g, são colocados sobre a placa aquecida e, as respostas ao estímulo térmico (retirada e lambida das patas traseiras ou dianteiras), cronometradas.

 

São feitas duas medidas-controle em intervalos de 30 minutos. Por meio dessas medidas se estabelece o tempo de “cut-off”, ou seja, o tempo máximo de permanência do animal sobre a placa, calculado como sendo aproximadamente 3 vezes o valor médio da 2ª medida-controle. Adotou-se, porém, um cut-off de 25 segundos devido a possíveis lesões que poderiam ser causadas na pata do animal pela exposição a tempos superiores.

 

A primeira leitura-controle tem o objetivo de adaptação dos animais ao ensaio. A segunda leitura-controle é utilizada para exclusão do ensaio dos animais que possuem período de latência superior a 9,9s, sendo considerada como a resposta-controle do tempo zero.

 

Os compostos são administrados em seguida à segunda leitura-controle, geralmente, por via oral, embora outra via de administração possa ser utilizada.

 

As medidas do tempo de resposta são registradas em intervalos de 30 minutos após a administração durante 2 horas (tempos: 30 min; 60 min; 90 min; 120 min). Os resultados são expressos em média ± EPM dos tempos registrados nos lotes de animais.

 

3.4 - Bibliografia

• KURAISHI; Y. et al. (1983) Separate involvement of the spinal noradrenergic and serotonergic systems in morphine analgesia: the differences in mechanical and thermal algesic tests. Brain Research, 273: 245-252. [Veja artigo original]

 

4. Teste de retirada da cauda (Tail Flick test)

4.1 - Animais

Camundongos ou ratos.

 

4.2 - Tipo de teste

Nocicepção térmica manifesta por reflexo de retirada de cauda.

 

4.3 - Detalhamento do teste

A analgesia promovida pelo sistema nervoso central também pode ser avaliada por meio do teste de tail flick, ou retirada de cauda. Este teste pode ser realizado tanto com camundongos quanto com ratos. De acordo com KURAISHI et al (1983), camundongos suíços de ambos os sexos com pesos entre 18 e 25g, mantidos em jejum por um período de 8 h, ou ratos pesando entre 100 e 200 g, são colocados no aparelho com a cauda sobre a lâmpada (intensidade 9 no aparelho analgesy meter, modelo 7106 da Leticaä) e o tempo que os animais levam para retirar a cauda após a aplicação do estímulo térmico é cronometrado.

 

Da mesma maneira que o teste anterior (hot plate), são feitas duas medidas-controle em intervalos de 30 minutos. Por meio dessas medidas se estabelece o tempo de “cut-off” (máximo de permanência da cauda sobre a lâmpada), calculado como sendo de aproximadamente 3 vezes o valor médio da 2ª medida-controle. Adotou-se, porém, um cut-off de 15s, devido a lesões causadas na cauda quando exposta a um tempo superior a este.

 

A primeira leitura-controle tem o objetivo de adaptação dos animais ao ensaio. A segunda leitura-controle é utilizada para exclusão do ensaio animais que possuem período de latência superior a 7,9s, sendo considerada a resposta-controle do tempo zero.

 

As drogas a serem testadas são administradas em seguida à segunda leitura-controle, geralmente por via oral, podendo, contudo, ser utilizada outra via de administração.

 

As medidas do tempo de resposta são registradas em intervalos de 30 minutos após a administração, durante 2 horas (tempos: 30min; 60min; 90min; 120min). Os resultados são expressos em média + EPM dos tempos registrados nos lotes de animais.

 

4.4 - Bibliografia

• KURAISHI; Y. et al. (1983) Separate involvement of the spinal noradrenergic and serotonergic systems in morphine analgesia: the differences in mechanical and thermal algesic tests. Brain Research, 273: 245-252. [Veja artigo original]

5. Teste da placa quente modificado

5.1 - Animais

Ratos.

 

5.2 - Tipo de teste

Nocicepção térmica manifesta por reflexo de retirada da pata.

 

5.3 - Detalhamento do teste

Ratos Wistar pesando 120-200g são colocados individualmente no equipamento que consiste de uma placa quente com temperatura ajustada em 51ºC. A latência da resposta de retirada da pata traseira esquerda é determinada 0, 30, 60, 120, 180, e 240 min após a administração do estímulo hiperalgésico, que pode ser feita por diversas vias de administração (intraplantar, intratecal, via oral, etc). O tempo máximo permitido para permanência dos animais na superfície quente é 20s. Os experimentos devem ser feitos em ambiente sem barulho e com ar condicionado (20-22ºC).

 

A sensibilidade ao calor (hiperalgesia térmica) é definida como o decréscimo no tempo de retirada da pata e calculada como a seguir: Δ latência de retirada de pata (s) = (latência de retirada de pata esquerda no tempo 0) – (latência de retirada de pata esquerda nos demais tempos).

 

5.4 - Bibliografia

• LAVICH, T.R. et al. (2003) Combined action of vasoactive amines and bradykinin mediates allergen-evoked thermal hyperalgesia in rats. Eur J of Pharmacol. 61039, 1-8; [Veja artigo original]

• LAVICH, T.R. et al. (2005) A novel hot-plate test sensitive to hyperalgesic stimuli and non-opioid analgesics. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38, 445 – 451. [Veja artigo original]

6. Teste de Randall & Selitto

6.1 - Animais

Ratos.

 

6.2 - Tipo de teste

Hiperalgesia por pressão crescente na pata de ratos.

 

6.3 - Detalhamento do teste

O teste comportamental de Randall & Selitto (1957) é um método para avaliação da hipernocicepção bastante utilizado. Para a execução deste teste utiliza-se equipamento apropriado denominado analgesímetro (Ugo-Basile, Stoelting, Chicago, IL), que gera aumento linear da força (em gramas) sobre a superfície dorsal da pata do animal, até que o mesmo produza uma resposta caracterizada pela retirada da pata. O reflexo de retirada da pata é considerado representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária aplicada à pata para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar Nociceptivo de Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração dos estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o experimento. Para reduzir o stress, os ratos devem ser habituados ao equipamento 1 dia antes da execução do experimentos.

 

6.4 - Bibliografia

• Randall LO, Selitto JJ. A method for measurement of analgesic activity of inflamed tissue. Arch Int Pharmacodyn, 1957;111:409-419. [Veja artigo original]

7. Teste de pressão crescente na pata de ratos (von Frey eletrônico)

7.1 - Animais

Ratos, embora o teste também possa ser realizado em camundongos.

 

7.2 - Tipo de teste

Hiperalgesia por pressão crescente na pata de ratos.

 

7.3 - Detalhamento do teste

Vídeo 3: Demonstrativo do teste de pressão crescente na pata de ratos (arquivo MPEG, tamanho aproximado 2MB)

O uso de filamentos de von Frey (von Frey, 1896) é um método para avaliar a sensibilidade tecidual ao estímulo mecânico bastante utilizado clinicamente. Entretanto, tal método passou a ser utilizado também para experimentos laboratoriais, no sentido de avaliar a influência de drogas sobre a sensibilidade nociceptiva em animais. Mais ainda, essa técnica foi transformada em um método eletrônico usado primeiramente em humanos (JENSEN et al., 1986) e posteriormente em ratos (MÖLLER et al., 1998).

 

Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico (Modelo 1601C, Life Sciences Instruments, Califórnia, EUA), que consiste em um transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas (g). A precisão do aparelho é de 0,1 g. O aparelho é calibrado para registrar uma força máxima de 150 g, mantendo a precisão de 0,1 g até a força de 80 g. O contato do transdutor de pressão à pata dos animais é realizado por meio de uma ponteira descartável de polipropileno com 0.5 mm de diâmetro adaptada a este. Os animais (ratos ou camundongos) são colocados em caixas de acrílico, cujo assoalho é uma rede de malha igual a 5 mm2 constituída de arame não maleável de 1 mm de espessura, durante 15 minutos antes do experimento para adaptação ao ambiente. Espelhos são posicionados 25 cm abaixo das caixas de experimentação para facilitar a visualização das plantas das patas dos animais. O experimentador deve aplicar, por entre as malhas da rede, uma pressão linearmente crescente no centro da planta da pata do rato ou camundongo até que o animal produza uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata estimulada. Os estímulos são repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara resposta de “flinch” após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção é quantificada como a variação na pressão (D de reação em gramas) obtida subtraindo-se a média de três valores expressos em gramas (força) observada antes do procedimento experimental (0 hora) da média de três valores em gramas (força) após a administração dos estímulos que variam de acordo com o experimento.

 

 

7.4 - Bibliografia

• JENSEN K, ANDERSEN HO, OLESEN J, LINDBLOM U. (1986) Pressure-pain threshold in human temporal region. Evaluation of a new pressure algometer. Pain. 25, 313-323. [Veja artigo original]

• MOLLER KA, JOHANSSON B, BERGE OG. (1998) Assessing mechanical allodynia in the rat paw with a new electronic algometer. J Neurosci Methods, 84, 41-47. [Veja artigo original]

• VIVANCOS GG, VERRI WA JR, CUNHA TM, SCHIVO IR, PARADA CA, CUNHA FQ, FERREIRA SH. An electronic pressure-meter nociception paw test for rats. Braz J Med Biol Res. 2004 Mar;37(3):391-9. [Veja artigo original]

• CUNHA TM, VERRI WA JR, VIVANCOS GG, MOREIRA IF, REIS S, PARADA CA, CUNHA FQ, FERREIRA SH. An electronic pressure-meter nociception paw test for mice. Braz J Med Biol Res. 2004 Mar;37(3):401-7. [Veja artigo original]

 

8. Teste de pressão constante na pata de ratos

8.1 - Animais

Ratos.

 

8.2 - Tipo de teste

Hiperalgesia por pressão constante na pata de ratos.

 

8.3 - Detalhamento do teste

Vídeo 4: Demonstrativo do teste de pressão constante na pata de ratos (arquivo MPEG, tamanho aproximado 5,7 MB)

Nesta técnica, primeiramente descrita por Randall & Selitto (1957) e modificada por Ferreira et al., (1978), o animal é colocado em uma plataforma e mantido em decúbito ventral pela mão do experimentador. Qualquer uma das patas traseiras é submetida à pressão constante de 20 mmHg aplicada por um pistão de diâmetro aproximado de 2 cm. A pressão é interrompida quando o animal exibe reação nociceptiva típica caracterizada por redução dos movimentos de fuga, seguida de alterações na freqüência respiratória e fasciculações no dorso. A intensidade de hipernocicepção é quantificada pela variação do tempo de reação em segundos (D do tempo de reação) obtida subtraindo-se o tempo de reação observado antes do procedimento experimental (0 hora) do tempo de reação após a administração de substâncias que promovem sensibilização dos nociceptores que variam de acordo com o experimento.

 

8.4 Bibliografia

• FERREIRA SH, LORENZETTI BB, CORREA FM. (1978) Central and peripheral antialgesic action of aspirin-like drugs. Eur J Pharmacol. 53, 39-48. [Veja artigo original]

• RANDALL LO, SELITTO JJ. A method for measurement of analgesic activity of inflamed tissue. Arch Int Pharmacodyn, 1957;111:409-419. [Veja artigo original]

 

 

9. Hiperalgesia térmica por fonte de luz infravermelha na pata traseira de rato (Teste de Hargreaves)

9.1 - Animais

Ratos.

 

9.2 - Tipo de teste

Hiperalgesia térmica por aplicação de luz quente na pata de ratos.

 

9.3 - Detalhamento do teste

Vídeo 5: Demonstrativo do teste de Hargreaves (arquivo MPEG, tamanho aproximado 5,5 MB)

O teste de Hargreaves foi descrito 1988 e consiste no aquecimento, por meio de uma fonte radiante de luz infravermelha, da região central da planta da pata traseira de ratos. O comportamento nociceptivo é avaliado como a sensibilidade ao calor (hipernocicepção térmica), determinada pela latência de retirada da pata do raio de luz. Contudo, o limite máximo permitido para exposição da pata ao raio infravermelho é 15 segundos, no sentido de evitar danos teciduais.

 

Os animais são colocados em compartimentos de acrílico individuais posicionados sobre uma superfície de vidro especial, que permite a passagem de forma homogênea da luz e do calor. Cinco minutos são utilizados para adaptação dos animais ao ambiente. Após esse período, a fonte de luz infravermelho, colocada sob cada uma das patas traseiras do animal, é acionada juntamente com um cronômetro eletrônico, até que o animal retire a pata e, a fonte de luz e o relógio parem automaticamente.

 

Duas ou três medidas são realizadas com um intervalo de tempo de 5 a 10 minutos entre as mesmas. As medidas de latência de retirada da pata são expressas como avaliações percentuais relativas às patas-controle (contralaterais) em cada tempo de observação.

 

9.4 Bibliografia

• HARGREAVES K, DUBNER R, BROWN F, FLORES C, JORIS J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988 Jan;32(1):77-88. [Veja artigo original]